Amerikan biyokimyager Karry Mullis, polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) cihazının mucididir (1983).[1] 1993 yılında Michael Smith ile geliştirdikleri bölgeye yönelik mutajenez (site-directed mutagenesis) yani DNA’da istenilen bölgeye yönelik mutasyon sağlama tekniği sayesinde Nobel Ödülü paylaştılar. Mutasyonu burada iki taraflı düşünebiliriz. Daha da açacak olursak, bu yöntem yıllar içinde gelişmiş ve insanlığa, var olan genetik hastalıkların aynısını model organizmalara uyarlamada kullanılarak büyük katkı sağlanmıştır. Hastalığa sebebiyet veren bölgeye yönelik mutajenez yöntemi ile model organizmalarda hastalığa sebebiyet veren mutasyonu elde ederek daha detaylı inceleme ve tedavi geliştirme başarısı sağlıyor. Tedavi yöntemlerinden biri olarak ise gen terapisi üzerine çalışmalar yürütülüyor ve bölgeye yönelik mutajenez ile zararlı mutasyona uğramış gen yeniden mutasyona uğratılarak sağlıklı bireylerde bulunan dizilim hâline getiriliyor. Anlaşılacağı üzere, Karry Mullis bilim dünyasında çok saygın bir yere sahip.
PCR cihazlarına yeniden dönüp yazının ana konusuna odaklanacak olursak, pandeminin başından beri ortada dönüp dolaşasan, PCR üreticisinin yani Mullis’in PCR ile virüs tespit edilmez sözüne bir bakalım. Mullis PCR’ı 1983 yılında icat etti.[1] Mullis geleneksel PCR’ı icat etti.[1] Mullis kendi ürettiği PCR’ın virüs tespitinde kullanılamayacağını söyledi. Şuan 2021 yılındayız. 1983 senesinin üzerinden 38 sene geçti. 19. yüzyılın sonlarında Antonio Meucci veya Graham Bell (hangisini ilk kabul ederseniz), telefon ile görüntülü konuşabilirsiniz dedi mi? Hayır. Aynı mı kaldı o günden bugüne telefon? Sayamayacağım kadar model eklendi ve üzerine kat ve kat özellikler ilave edildi. Peki PCR aynı mı kaldı? Geleneksel PCR kullanılmaya devam ediliyor, evet. Yine de her geçen gün daha etkin ve daha hassas sonuç nasıl alınabilir diye hayatlarını bu konuya adayan araştırmacıların iyileştirmeleriyle geliştiriliyor. Şu an sadece benim aklıma gelen 12 PCR çeşidi var. Hepsinin kullanım amacı farklı. COVID-19 için kullanılan tür geleneksel PCR değil. Çünkü geleneksel PCR virüs tespiti için kullanılamaz. COVID-19 için kullanılan PCR, RT-PCR cihazıdır. Geleneksel PCR ve RT-PCR’ın da dâhil olduğu birkaç PCR türüne değinerek devam edelim yazıya. Teknik detaylarını es geçip kullanım amaçlarının en temellerine odaklanalım.
1. Standart (Geleneksel) PCR
Günümüzde kullanımı devam etmektedir ve kullanım amacı DNA’yı kopyalayıp çoğaltarak analiz yapabilecek miktara getirmek. Geliştirilmiş PCR cihazları kullanımında da hâlen ara aşama veya ön aşama olarak kullanılıyor. Biyoloji ve tıbbi laboratuvarlarda hâlen büyük katkılar sağlamaktadır.
2. Multiplex PCR
- Klinik tanı. (örneğin patojen enfeksiyonu, genetik değişiklikler).-
- Fen bilimleri araştırmaları.
- Adli tıp laboratuvarları.
Geleneksel PCR’ın bu geliştirilmiş türü, gende meydana gelen silinmeler veya dublikasyonları hızlı bir şekilde tespit etmeye yarar. Tek kullanımda birden fazla geni hedef alabildiği için adli tıp laboratuvarlarında da kullanımı popülerdir.[2][3][4][5]
3. Nested PCR
- Cinsiyet belirleme.
- Annelik/babalık testi.
- Adli vakalarda kimlik tespit etme.
- Genetik çeşitlilik tespiti. (örneğin HPV virüsünün özel alt türünün tespiti)
Hedeflenen DNA’yı veya geni tespit etme aşamasında, benzer kısımların eşleşerek yanlış pozitif sonuç vermesini engellemek için geliştirilmiştir. Çok hassas bir ölçüm yaparak doğru tespit yapmaya büyük katkı sağlıyor.[6][7][8][9]
4. RT-PCR, RT-qPCR, Real Time RT-PCR, Real Time qPCR
RT-PCR çeşitli türlere sahip, bu çeşitli türler benzer ama ince detaylarla ayrılan özelliklere sahip. COVID-19 tespitinde kullanılan PCR türleri de RT-PCR cihazlarıdır. Hassas ölçüm yapma ve hızlı sonuç vermeye yarayan geliştirilmiş cihazlardır.[1] Viral genetik materyal tespitinde pandemiden önce kullanılıyorlardı ve hepsi kullanım onayı aldı.[10] Viral enfeksiyon tespitinde kullanılamaz diye ortada dönen iddialar asılsızdır. COVID-19’un bakteri olduğunu iddialarına yorum dahi yapmak istemiyorum, sadece mikroskopla bakıp virüsü bakteriden ayırt edebiliyoruz iyi ki diyorum.
- RNA genetik materyalini DNA’ya dönüştürmek.
- Virüslerin tespiti.
- Epidemiyolojik Çalışmalar.[11]
Son Söz
Sapla samanı birbirinden ayırmak, her şey burada başlar; sapla samanı birbirinden ayıramamak, her şey burada biter. Referansları ve açıklamaları bir kenara bırakırsak, bizzat RT-PCR ile virüs enfekte ettiğim model organizmalarda aradığım virüsü tespit ettim, enfekte etmediğim sağlıklı model organizmalarda virüs yoktu. Kendi gözlerimle gördüm. Dilerim ki bu güven için en net ve en basit açıklama olur.
Klavye başında veya sohbet esnasında yapılan her yeni tanım, her yeni tespit, her yeni icat ve her yeni komplo teorisi, bilim emekçilerinin emeklerine hakarettir.
Referanslar
[1] Singh, J., Birbian, N., Sinha, S., & Goswami, A. (2014). A critical review on PCR, its types and applications. Int J Adv Res Biol Sci, 1(7), 65-80.
[2] Mahony, J., Chong, S., Merante, F., Yaghoubian, S., Sinha, T., Lisle, C., & Janeczko, R. (2007). Development of a respiratory virus panel test for detection of twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay. Journal of clinical microbiology, 45(9), 2965.
[3] Yost, C. K., & Nattress, F. M. (2000). The use of multiplex PCR reactions to characterize populations of lactic acid bacteria associated with meat spoilage. Letters in Applied Microbiology, 31(2), 129-133.
[4] Hendolin, P. H., Markkanen, A., Ylikoski, J., & Wahlfors, J. J. (1997). Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial species in middle ear effusions. Journal of clinical microbiology, 35(11), 2854.
[5] Hayden, M. J., Nguyen, T. M., Waterman, A., & Chalmers, K. J. (2008). Multiplex-ready PCR: a new method for multiplexed SSR and SNP genotyping. BMC genomics, 9(1), 1-12.
[6] Chen, K., Zhou, Y. X., Li, K., Qi, L. X., Zhang, Q. F., Wang, M. C., & Xiao, J. H. (2016). A novel three-round multiplex PCR for SNP genotyping with next generation sequencing. Analytical and bioanalytical chemistry, 408(16), 4371-4377.
[7] Strom, C. M., & Rechitsky, S. (1998). Use of nested PCR to identify charred human remains and minute amounts of blood. Journal of Forensic Science, 43(3), 696-700.
[8] Haws, A. L. F., He, Q., Rady, P. L., Zhang, L., Grady, J., Hughes, T. K., … & Tyring, S. K. (2004). Nested PCR with the PGMY09/11 and GP5+/6+ primer sets improves detection of HPV DNA in cervical samples. Journal of virological methods, 122(1), 87-93.
[9] Haff, L. A. (1994). Improved quantitative PCR using nested primers. Genome Research, 3(6), 332-337.
[10] Nikonova, A. A., Uspenskaia, E. S., Lobodanov, S. A., Oksanich, A. S., Gorbalenia, A. E., Claas, E. C., … & Faĭzuloev, E. B. (2009). Use of multiplex PCR method with real-time detection for differential diagnosis of respiratory viral infections. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii, (1), 67-70.
[11] Rajalakshmi, S. (2017). DIFFERENT TYPES OF PCR TECHNIQUES AND ITS APPLICATIONS. International Journal of Pharmaceutical, Chemical & Biological Sciences, 7(3).
Kapak fotoğrafı: IAEA Imagebank, Flickr.